天然HIV蛋白酶抑制剂的分离与苯并呋喃类化合物的合成及活性研究

【摘要】艾滋病(AIDS)是一种由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的免疫和中枢神经系统的退行性疾病。HIV-1逆转录酶、蛋白酶和整合酶是HIV-1基因在复制过程中的3个关键酶,到目前为止抗HIV/AIDS药物的研究与开发主要是针对这3个关键酶进行设计的。蛋白酶抑制剂能防止病毒母体蛋白分裂成新的HIV感染细胞和病毒复制的功能蛋白,这一发现使艾滋病的治疗有了突破性进展。目前人们已经制备了大量的肽类和非肽类HIV蛋白酶抑制剂。目前已在临床广泛应用的HIV蛋白酶抑制剂有：沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦等,然而长期使用这些蛋白酶抑制剂产生明显的毒副作用和耐药性。因此寻找新的HIV蛋白酶抑制剂成为艾滋病治疗更有效的途径。从微生物发酵产物中分离提取活性物质是发现新型药物先导化合物的重要途径。本工作选择一株阳性菌株链霉菌I03A-04862(CGMCC4766),采用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型进行活性跟踪,对发酵液中的活性成分进行了分离纯化,利用大孔树脂HP-20柱层析、ODS柱层析和HPLC制备柱层析等色谱方法分离得到一个活性较好的化合物,命名为4862F。通过ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、TOCSY、ROESY等波谱解析方法对该化合物进行了结构解析,发现其结构特征为含有一个N,N,N-三甲基取代的氨基酸。最终确定4862F为一个由五个氨基酸链接的寡肽,其中有两个亮氨酸,一个缬氨酸,一个脱氢组氨酸和一个N,N,N-三甲基取代的酪氨酸,五个氨基酸的连接顺序为N,N,N-(trimethyl)-Tyr-Leu-Val-Leu-(-2H)-His。该化合物经ScifinderScholarCA网络版数据库和Reaxys数据库检索,尚未见文献报道。该化合物在高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型上的半数抑制率IC50为15.26nM。采用CPE法测定其对MDCK细胞的半数毒性浓度CC50大于292.83μM。本实验得到的化合物活性较好,细胞毒性小。对其进行结构改造,有希望得到新的活性更好的HIV-1蛋白酶抑制剂,有进一步开发的价值。蛋白酶抑制剂已成为艾滋病治疗和丙型肝炎治疗的研究重点。但目前已进入临床试验的这两类肽类蛋白酶抑制剂效果不甚理想,口服吸收率低,成本较高,因此研究人员越来越关注非肽类蛋白酶抑制剂的研究。在文献调研过程中,我们发现苯并呋喃类化合物是一类具有很强生物活性的化合物,它广泛存在于天然和非天然产物中,具有抗病毒、抗肿瘤和抗骨质疏松等活性。最近,又有研究发现在母环上稠合吡啶或者嘧啶类杂环具有抗HIV病毒、抑制HIV-1逆转录酶和抑制HCVNS34A蛋白酶活性。本部分研究工作在参考文献合成路线和活性数据的基础上,分别以凯林和齿阿米素两个苯并呋喃类化合物为原料,经过水解和Vielsmeier-Haack反应,与2-氨基六元含氮杂环类化合物进行了加成,共获得26个化合物,其中4个中间体,3个非目标产物,20个目标化合物。所有产物的结构均经1H-NMR和ESI-MS分析确证。其中,目标化合物的结构经1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1HHMBC和ESI-MS分析确证。所有化合物经SciFinderScholarCA网络版数据库和Reaxys数据库检索,有21个化合物尚未见文献报道,其中含目标化合物20个本论文得到的目标化合物与文献报道的化合物结构类型不同。分析了目标化合物的反应机理,可能为2-氨基六元含氮杂环类化合物与溶剂甲醇对母核上的共轭双键发生了二次加成,同时脱掉一分子水所致。由于在加成的过程中,甲醇对6,7-位双键的进攻方向无选择性,导致目标化合物以外消旋体的形式存在,这点可以从比旋光度接近于零和晶体X-射线衍射中晶胞堆积图中得到证实。测定所得化合物HIV-1蛋白酶抑制活性、HCVNS34A蛋白酶抑制活性、抗HIV-1假病毒活性、HIV-1逆转录酶抑制活性、抗骨质疏松活性、抗流感甲型病毒活性及对肿瘤细胞和正常细胞的毒性。其中,化合物K-10、K-11和K-14对HCVNS34A蛋白酶有较好的抑制活性。化合物K-6和K-18对HIV-1蛋白酶有较好的抑制活性。对结构进行改造,以增强HCVNS34A蛋白酶抑制活性和HIV-1蛋白酶抑制活性将是下一步工作的研究重点。分析了各活性化合物在各模型上的构效关系,这对下一步的研究工作起到导向作用,有一定的指导意义。
【作者】刘晓；
【导师】司书毅；
【作者基本信息】北京协和医学院，微生物与生化药学，2011，博士
【关键词】HIV-1蛋白酶抑制剂；寡肽；高通量荧光检测；微生物产物；HCVNS34A蛋白酶抑制剂；苯并呋喃类；凯林；合成；

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